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細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)定量

細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)定量


 

Solarbio提供的細(xì)胞裂解液

貨號

R0010

R0020

R0030

名稱

RIPA組織細(xì)胞裂解液

RIPA組織細(xì)胞裂解液

非變性組織細(xì)胞裂解液

有效裂解成分

SDS,NP-40,脫氧膽酸鈉,

1% NP-40,0.1% SDS

NP-40,Triton X-100

裂解強(qiáng)度

強(qiáng)

溫和

蛋白酶抑制劑

含, 配有PMSF

含,配有PMSF

含,配有PMSF

產(chǎn)物

細(xì)胞總蛋白

細(xì)胞總蛋白

細(xì)胞總蛋白

蛋白狀態(tài)

變性

變性

保持活性狀態(tài)

主要用途

WB、IP

WB、IP

WB, IP,co-IP

本系列試劑隨同配送一支PMSF,請收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存,如發(fā)現(xiàn)有少量沉淀,可常溫放置半小時,沉淀可消失,不影響使用。

使用裂解液在提取核蛋白的同時,也會將基因組一并釋放出來,細(xì)胞量高時會造成細(xì)胞裂解液粘稠,此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液,煮沸再離心,離心取上清直接上樣電泳;若想測定濃度,可入加少量SDS(1%),煮沸后離心測濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑,所以不適合使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒,請選擇BCA法或者Lowry法檢測蛋白濃度。

       如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。

 

蛋白質(zhì)定量:

蛋白含量測定是以標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對照,根據(jù)蛋白濃度不同,吸光值不同而達(dá)到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值(紫外光譜吸收法)來定量,但更多的是用染料對蛋白進(jìn)行染色,利用染料與蛋白結(jié)合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。后一種方法應(yīng)用更普遍。

蛋白定量方法的選擇,應(yīng)該考慮到蛋白結(jié)構(gòu)(標(biāo)準(zhǔn)品選擇)、蛋白溶液內(nèi)干擾物等因素的影響。

 

 

Bradford法

BCA法

Lowry法 

原理

考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色,在波長595nm吸收峰

基于雙縮脲原理,堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu1+,BCA螯合Cu+作為顯色劑,產(chǎn)生蘭紫色并在562nm有吸收峰。

Folin-酚法,蛋白質(zhì)在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合,形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物,還原酚磷鉬酸產(chǎn)生藍(lán)色化合物。

靈敏性

微量:1-10ug/ml,

常規(guī):100-1500ug/ml

很高

微量:0.5-20μg/ml

常規(guī):20-2000ug/ml

較高

1-1500ug/ml

干擾因素

強(qiáng)堿性緩沖液

TritonX-100

SDS等去污劑

螯合劑

略高濃度的還原劑

(優(yōu)勢:耐受一般濃度去污劑)

硫酸銨;Tris緩沖液

甘氨酸、各種硫醇

(優(yōu)勢:適用于脂類含量高的樣品測定。耐受去垢劑如SDS)

應(yīng)用

快速5-15min

顏色穩(wěn)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性

較快40min

較好的方法

抗干擾能力強(qiáng)

耗費(fèi)時間長50min

操作要嚴(yán)格計時

顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差且專一性差

 

考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的大吸收峰的位置(lmax),由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5分鐘20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)干擾此法的測定。  

BCA(bicinchoninic acid)是理想的蛋白質(zhì)定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠,對不同種類蛋白質(zhì)檢測的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是,在堿性條件下,蛋白將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物,測定其在562nm處的吸收值,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比,即可計算待測蛋白的濃度。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實驗中,低濃度的去垢劑SDS,Triton X-100,Tween不影響檢測結(jié)果,但螯合劑(EDTA,EGTA)、還原劑(DTT,巰基乙醇)和脂類會對檢測結(jié)果有一定影響。實驗中,若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高,可試用Bradford法測定蛋白濃度。

Lowry蛋白質(zhì)測定法是靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用廣泛的一種方法,在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。這個測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,缺點(diǎn)是費(fèi)時間較長,要控制操作時間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。

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